番茄(Solanum lycopersicum Mill.)属于茄科番茄属，是世界上最重要的蔬菜作物之一(李敏, 2005)。近年来，番茄黄化曲叶病毒病(tomato yellow leaf curl virus disease, TYLCD)严重地危害番茄产业的发展。由于全球气候的变化、农业耕作制度的改变和烟粉虱介体在世界各地广泛地扩展，TYLCD在世界范围内大面积爆发流行(Varma and Malathi, 2003; 叶青静等, 2009)。据初步统计，至少有40个国家的番茄正遭受此类病害的毁灭(Accotto et al., 2000; Boulton, 2003)。该病害由番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)引发，一旦被病毒侵染，会造成番茄果实变小、产量下降，最终可能会导致绝收(宋建军等, 2010)。2005年，番茄黄化曲叶病毒病首次在中国广西被发现，近年来国内大部分番茄产区也受到该病毒的侵染，发病面积及程度都呈现逐年加重的趋势(Xu et al., 2007; 何自福等, 2007; 赵统敏等, 2007; 王冬生等, 2006, 长江蔬菜, 10: 25-26; 蔡健和等, 2006, 中国蔬菜, 7: 47-48)。

番茄黄化曲叶病毒是双生病毒(Geminiviridae)科菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的一类病毒，靠烟粉虱(Bemisia tobaci)进行传播(谢艳等, 2002)。该病毒是具有孪生颗粒形态的单链环状DNA (single stranded DNA, ssDNA)，基因组由2个组分(DNA-A和DNA-B)组成，每个组分的大小为2.5~2.8 kb (Fauquet et al., 2005; 于力, 2008)。目前国内发现的番茄黄化曲叶病毒大多为DNA-A，基因组大小为2 781个核苷酸左右。该病毒的同源性主要受地域、气候环境、以及人类活动等的影响(岳宁等, 2008)。近年来，一些研究者对部分地区的TYLCV进行了分子鉴定与序列分析，取得了初步的成果(Zhang et al., 2008; 褚栋等, 2010; 何自福等, 2007; 田鹏等, 2012)。

本研究对浙江省的TYLCV进行分子鉴定，克隆病毒分离物的全长序列，分析其结构特征，序列同源性及系统发育关系，为今后揭示TYLCV的致病机理奠定基础。

1结果与分析
1.1番茄黄化曲叶病毒的田间感病表现和初步鉴定
从浙江省田间采集的番茄感病植株样品，其感病症状表现为植株生长缓慢或停滞，严重矮缩，上部叶片黄化、边缘向上卷曲，植株坐果少而小。感病植株的发病症状与叶青静等(2009)定义的番茄黄化曲叶病毒病的典型症状一致。

以感病叶片上的病毒DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。设置两次生物学重复，并以未发病的健康番茄植株叶片为对照。病毒样品扩增得到大小为654 bp的特异性条带，健康植株的样品无条带出现(图1)。对特异性条带进行回收、克隆和测序，将测序结果在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上进行BLAST比对，证实与番茄黄化曲叶病毒中的AV1基因相关，表明该序列为TYLCV分离物的一个片段。

图1  凝胶电泳检测结果 Figure 1 The results of gel electrophoresis testing

1.2番茄黄化曲叶病毒的全长及其基本结构
利用上一测序结果设计反向引物，分别设置两次技术重复，对病毒分离物的近全长序列进行PCR扩增，得到与预期大小一致的目的片段，健康植株的样品无条带出现(图2)。对该特异性条带进行回收、克隆和测序，测序结果表明目的片段大小为2 405个核苷酸。使用DNAMAN软件将两次测序结果拼接，结果获得全长为2 781个核苷酸的DNA-A序列。

图2 凝胶电泳检测DNA-A近全长序列结果 Figure 2 The nearly whole sequence of gel electrophoresis testing

根据测序结果向Genbank提交病毒分离物的全长序列，获得登录号为JX675237。使用NCBI在线工具Open Reading Frame Finder (ORF Finder) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找该序列的开放阅读框，结果表明该序列共编码6个开放阅读框，分别为位于病毒链上的AV2基因(148~498 nt, 编码与抑制寄主RNA沉默相关的蛋白)、AV1基因(308~1 084 nt, 编码外壳蛋白)和以及位于互补链上的AC3基因(1 081~148 nt, 编码复制增强蛋白)、AC2基因(1 226~1 633 nt, 编码转录激活蛋白)、AC1基因(1 542~2 615 nt, 编码复制相关蛋白)、和AC4基因(2 171~2 464 nt, 编码蛋白在叶绿体和线粒体中积累, 是RNA沉默的强抑制子)。此外，在AC1和AV2之间还有一个较长的非编码区，称为IR (intergenic region, IR)区，此区域包含病毒复制、转录起始和包装所需的序列，该区域含有茎环结构、保守的九核苷酸序列TAATATTAC和TATA盒以及重复序列CAATCGGG和GGGTCG等，这些结构特点均为番茄黄化曲叶病毒共有的典型特征(Xie et al., 2002)。

1.3番茄黄化曲叶病毒的同源性分析
选取NCBI上有代表性的TYLCV的DNA-A序列，与本研究中的TYLCV进行同源性分析。序列包括国内不同省份地区的TYLCV，国外不同地区的病毒分离物以及国际病毒委员会根据不同株系划分的几种分离物(表1)。

表1 部分其它已知的TYLCV的基本特征 Table 1 The characteristic of selected other known TYLCV

将病毒分离物的全长序列与其它病毒序列进行同源性的比对结果发现：在核苷酸水平上本研究中的病毒分离物与美国的病毒同源性最高，达到99.6%，与中国云南的病毒同源性最低，为75.2%，与浙江、江苏、安徽、上海和北京几个国内地区的病毒同源性均在99%以上，与其它地区的病毒同源性也均在94%以上(表2)。本研究进一步对TYLCV中(AV1, AV2, AC3, AC2, AC1和AC4)6个基因编码的蛋白序列进行同源性分析，结果表明：AV1的同源性为78.5%~100%；AV2的同源性为74.8%~100%，除云南外，本研究中AV2的同源性与国内几个省份地区均高达100%。AC3的同源性为72.4%~98.5%；AC2的同源性为59%~98.5%；AC1的同源性为78.2%~100%；AC4的同源性为67%~100%。

表2 TYLCV的核苷酸及各编码区的同源性比较 Table 2 Homology comparison of nucleotides and encoding region in TYLCV

1.4番茄黄化曲叶病毒的系统发育关系分析
为了进一步揭示TYLCV的系统发育关系，我们根据国内外不同地区的TYLCV并结合本研究中的病毒分离物的全长序列进行系统发育进化树的构建(图3)。结果显示，除与来自云南和伊朗的TYLCV的亲缘关系较远外，其他TYLCV分为三个组分，山东等五个国内地区与日本、韩国和澳大利亚分为第1组，而本研究中的病毒分离物与北京、江苏、美国及墨西哥的TYLCV分在第2组，剩下的荷兰等五个国外地区分为第3组。

 

图3 TYLCV的氨基酸序列系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree based on the TYLCV amino acid sequences

2讨论
本研究对浙江地区的番茄黄化曲叶病毒进行了分子鉴定与序列分析，结果表明从具有典型番茄黄化曲叶病毒病病症的植株上所采集的病毒，经过PCR检测与序列分析后，证实其确为TYLCV，且具有双生病毒的典型结构，同时也证明了PCR检测技术是一种快速、有效的病毒检测方法。该TYLCV病毒分离物序列全长为2 781 bp，NCBI上检索到的中国地区TYLCV的序列全长大多为2 781 bp (表1)，但是田鹏等(2012)克隆的河北地区的TYLCV序列全长为2 782 bp，余文贵等(2009)克隆安徽地区的TYLCV序列全长为2 786 bp，说明TYLCV的序列全长存在变异的特点。

核苷酸同源性分析表明，本研究中的TYLCV与国内的浙江、江苏、安徽、上海、北京几个省份地区的病毒同源性均在99%以上，与云南的病毒同源性最低，仅为75.2%，这说明此病毒在中国的南北地域差异较大，且受地理环境的影响；但是同时又与国外的一些地区如美国和墨西哥的同源性最大，在99.5%以上，这可能是由于受到人类的贸易往来活动、河流及风的传播等多重因素的影响，从而导致两地病毒的同源性较高。国际病毒委员会规定，双生病毒科病毒的全基因组核苷酸序列的同源性小于89%，两者为不同病毒，大于89%，则两者属于同一种病毒的不同株系(Fauquet et al., 2003; Padidam et al., 1995)。所以推测本研究中的病毒分离物与云南的病毒并不属于同一病毒，其它地区可能是同一病毒的不同株系。6个编码区同源性分析表明，除云南外，AV2的同源性与国内几个省份地区均为100%，推测其可能是受到中国特有的地域及气候环境影响的结果，这与岳宁等(2008)的研究结果一致。已有研究表明双生病毒的基因组中AV1基因是最保守的开放阅读框，同一地区双生病毒的AV1同源性最高(Hong and Harrison, 1995; Padidam et al., 1995)。在本研究中除云南外，AV1的同源性均在98.4%以上，仅次于AV2，在6个ORF中保守性相对较高，推测这可能是传播介体烟粉虱在各地区之间互相传毒而逐渐变异进化的结果(Harrison and Robinson, 1999)。此外，系统发育关系分析表明，浙江地区的病毒分离物与北京、江苏、美国及墨西哥划分为一组，说明与这四个地区病毒的亲缘关系较近。

番茄黄化曲叶病毒病传播广泛、危害严重，今后应进一步加强对该病毒变异、进化情况的追踪分析，培育出适合当地种植的番茄抗病新品种。本研究首次对浙江省的番茄黄化曲叶病毒进行分子鉴定和序列分析，为今后进一步研究该病毒的传播、变异与进化分析提供理论指导，也为番茄抗病新品种的选育奠定基础。

3材料与方法
3.1病毒样品的采集及总DNA提取
在浙江地区栽培的番茄中选取具有典型黄化曲叶病毒病症状(上部叶片黄化, 边缘向上卷曲, 植株严重矮缩)的植株，采集番茄叶片，保存于-80℃冰箱中备用。以未发病的健康番茄植株叶片为对照。采用改良的CTAB法提取病毒样品的总DNA (Accotto and Noris, 2007)，DNA样品储存于-20℃冰箱备用。

3.2 PCR扩增、克隆和序列测定
参照比对国际上公布的病毒全序列，根据GenBank上已经发表的TYLCVDNA-A全序列(TYLCV-ZJ3, 登录号: AM698117)的保守区域设计引物，扩增其保守区域的目的片段，上游引物F1：5'-CAGGCGATATAATCATTTCC-3；下游引物R1：5'-TCTCATACTTGGCTGCCTCC-3'。经PCR扩增后，对其产物进行回收、克隆和测序，根据测序结果设计反向引物扩增其近全长序列，上游引物为F2：5'-CCCTCTGGAATGAAGGAACA-3'；下游引物为R2：5'-TATCGAAGCCCTGATGTTCC-3'。经PCR扩增后，对其产物进行回收、克隆和测序。感受态与载体：感受态为DH5α感受态细胞，载体为pEASY-T1 (宝生物公司, 大连, 中国)。PCR反应条件为：第一阶段：预变性94℃ 3 min；第二阶段：变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 0.5~3 min (视扩增产物的长度而定)，共35个循环；第三阶段：延伸72℃ 10min。应反体系总体积为20 μL，包括2 μL Buffer (含Mg²⁺)，1 μL DNA模板，2 μL dNTPs，正反向引物各1 μL，0.2 μL Taq酶，加入12.8 μL去离子水定容。最后，将2次测序结果用DNAMAN (Version 7)软件拼接，获得病毒分离物的全长序列。

3.3序列同源性分析及系统进化树的构建
选取NCBI上有代表性的TYLCV的DNA-A序列，采用DNAMAN (Version 7)软件，对候选的TYLCV序列与本研究获得的序列进行同源性的比对，分别在核苷酸水平和氨基酸水平上分析其相似性。使用BioEdit软件的ClustalX程序对核苷酸序列进行多重比对(Xiang and Moore, 2005)，将Clustal多序列联配的结果输出到MEGA 5.0软件中(Tamura et al., 2007)，利用MEGA 5.0软件构建了邻接树(neighbor-joining, NJ)，并利用Bootstrapping方法(1000次)对这些进化树进行评估，构建系统发育树。

作者贡献
袁伟、万红建、王荣青和叶青静是本研究的实验设计和实验研究的执行人；袁伟，阮美颖、李志邈和刘云飞完成数据分析，论文初稿的写作；杨悦俭、周国治和姚祝平是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由浙江省公益技术研究农业项目(2011C22007)、公益性行业(农业)科研专项经费(201003065)、浙江省农业新品种选育重大科技专项(2012C12903)、国家高技术发展计划-863计划(2012AA100100)、国家自然科学基金(31071800)、浙江省自然科学基金(LQ12C150020)、浙江省蔬菜产业创新团队(2009R50026)、浙江省蔬菜产业创新团队(2009R50026)和浙江省重大科技攻关项目(2009C2006)共同资助。

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